پیش تغلیظ داروی رالوکسیفن به روش میکرواستخراج فاز مایع با استفاده از فیبر توخالی و اندازه گیری دارو به روش HPLC در مقادیر Trace

  رالوکسیفن برای درمان سرطان پستان و نازایی وابسته به‌اولیگومنوره یا آمنوره ثانویه مصرف‌ می‌شود. رالوكسیفن درمان جدیدی است كه اخیراً برای پیشگیری از پوكی استخوان ستون فقرات در دسترس قرار گرفته است. این دارو به صورت روزی یك قرص مصرف می‌گردد. از بعضی جهات این دارو شبیه استروژن عمل می‌كند، اما برخلاف آن باعث خونریزی از مهبل یا افزایش خطر ابتلاء به سرطان پستان نمیشود.

    در واقع شواهدی وجود دارد كه این دارو خانمها را از ابتلاء به سرطان پستان در حداقل سه سال اول شروع درمان محافظت می‌كند. رالوكسیفن در برطرف كردن مشكلات یائسگی خانمها مثل برافروختگی، احساس داغ شدن و عرق ریزش شبانه كمكی نمی‌كند.

مكانیسم اثر: رالوکسیفن از گروه داروهای  SERM(تعدیل کننده های انتخابی گیرنده استروژن) می باشد. این داروها در برخی بافت ها اثرات مشابه استروژن ( آگونیستی)، و در سایر بافت ها دارای اثرات مشابه نسبی و یا جلوگیری از اثر استروژن (آنتاگونیستی) دارند. رالوکسیفن در درمان سرطان های پاسخ دهنده به هورمون تجویز می شود و در این بافت به عنوان آنتاگونیست از فعال شدن گیرنده توسط استروژن های آندوژن جلوگیری می کند.

عوارض جانبی: گر گرفتگی، خونریزی واژن، توقف قاعدگی، خارش فرج، اختلالات گوارشی، التهاب تومور، کاهش تعداد پلاکتها، احتباس مایعات، طاسی، فیبروم رحم، اختلالات بینایی (تغییرات قرنیه، آب مروارید و رتینوپاتی‌) کاهش پلاکت‌ها یا گلبول‌های سفید خون، به‌ندرت کاهش نوتروفیل‌ها و تغییرات آنزیم‌های‌کبدی از عوارض جانبی دارو هستند.

     در این مطالعه یك روش میكرواستخراج فاز مایع با استفاده از فیبر توخالی به همراه كروماتوگرافی مایع با عملكرد بالا (HPLC) و دتکتور UV جهت پیش تغلیظ و شناسایی رالوکسیفن در پلاسما به كار برده شد. رالوکسیفن از 15 میلی‌لیتر محلول بازی نمـونـه بـا 11= pH بـه داخـل یـك حـلال آلـی( اکتانول) كه در منافذ دیواره فیبر قرار داشت استخراج شد. به دنبال آن این دارو از حلال آلی به داخل فاز گیرنده آب با ماهیت اسیدی با 5/2pH= كه در داخل فیبر قرار داشت وارد شد. در ادامه فاكتورهای موثر در میكرواستخراج كه شامل pH فاز دهنده و فاز گیرنده،  نوع حلال آلی،  قدرت یونی فاز دهنده، زمان استخراج سرعت هم‌زدن بررسی و بهینه شد. پس از استخراج دارو با شرایط بهینه فاكتور پیش تغلیظ  108درصد بازیابی 81 درصد حد تشخیص 3/0 نانوگرم بر میلی لیتر، محدود خطی بودنng/ mL 100-1 با  99/0R²= و  %35/3 RSD =  حاصل شد.

     کلید واژه: میکرواستخراج، هالوفایبر، پیش تغلیظ، فیبر توخالی، رالوکسیفن.

عنوان                                                     

 فهرست مطالب                                             صفحه

خلاصه فارسی .................................................... 1

مقدمه ....................................................... 3

فصل اول: کلیات

1-1. بیان مساله. 6

1-2. اهداف.. 6

فصل دوم: بررسی متون و مطالعات دیگران در این زمینه

2-1. مروری بر روش‌های استخراج مایع- مایع و میكرواستخراج مایع- مایع. 8

2-1-1. میكرواستخراج فاز مایع. 9

2-1-1-1. میكرواستخراج فاز مایع با تك قطره 9

2-1-1-2. میكرواستخراج فاز مایع با فیبر توخالی (HF-LPME) 11

2-1-1-2-1. اصول استخراج و سیستم‌های مختلف در استفاده از HF-LPME .. 12

2-1-1-2-2. جنبه‌های عملی و پیكربندی‌های مختلف HF-LPME. 15

2-1-1-2-3. میكرواستخراج فاز مایع از فضای فوقانی با فیبر توخالی. 18

2-1-1-3. میكرواستخراج فاز مایع با استفاده از انجماد حلال استخراج كننده 21

2-1-1-4. میكرواستخراج فاز مایع- مایع پخشی (DLPME) 21

2-1-2. استخراج فاز جامد. 22

2-2. كروماتوگرافی. 22

2-2-1. دسته‌بندی روش‌های كروماتوگرافی. 23

2-2-1-1. كروماتوگرافی مایع با كارایی بالا (HPLC) 23

2-2-1-2. دستگاه‌های كروماتوگرافی مایع. 25

2-2-1-2-1. مخزن فاز متحرك.. 26

2-2-1-2-2. سیستم‌های پمپ كننده 26

2-2-1-2-3. سیستم‌های تزریق نمونه. 27

2-2-1-2-4. ستون‌های كروماتوگرافی مایع. 28

2-2-1-2-5. دمای پیستون. 29

2-2-1-2-6. آشكارسازها 29

2-3. بررسی مطالعات HF-LPME. 33

2-4.  بررسی داروی مورد مطالعه. 35

2-4-1. فارماكوكینتیك دارو 35

2-4-2. مكانیسم اثر دارو 35

2-4-3. موارد مصرف دارو 36

2-4-4. منع مصرف و احتیاط. 36

2-4-5. عوارض جانبی. 36

2-4-6. تداخلات.. 36

2-4-7- دوز مصرفی. 36

2-5. اهمیت اندازه‌گیری رالوکسیفن. 37

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1. مواد شیمیایی و تجهیزات دستگاهی. 39

3-1-1. مواد شیمیایی، استانداردها و نمونه‌های حقیقی. 39

3-1-2. تجهیزات دستگاهی. 39

3-2. روش استخراج. 40

3-2-1. استخراج به اختصار طی مراحل زیر انجام گرفت: 41

3-2-2. مراحل بهینه‌سازی. 42

3-2-2-1. بهینه‌سازی شرایط جداسازی. 42

3-2-2-2. بهینه‌سازی شرایط استخراج. 42

3-2-2-2-1. نوع حلال آلی. 43

3-2-2-2-2. اثر pH فاز دهنده 43

3-2-2-2-3. اثر pH فاز گیرنده 43

3-2-2-2-4. اثر قدرت یونی فاز دهنده 43

3-2-2-2-5. اثر همزدن محلول آنالیت.. 43

3-2-2-2-6. اثر زمان استخراج. 43

3-2-2-2-7. اثر دما بر استخراج. 43

3-2-3. ارزیابی كارایی روش استخراج. 44

3-2-3-1. منحنی درجه‌بندی. 44

3-2-3-2. تعیین فاكتور پیش تغلیظ (PF) 44

3-2-3-3. تعیین تكرارپذیری (RSD) 45

3-2-4. آنالیز نمونه حقیقی. 45

فصل چهارم: نتایج

4-1. میكرواستخراج سه فازی بر پایه استفاده از فیبر توخالی متخلخل. 47

4-1-1. اصول تئوری. 47

4-2. مراحل بهینه‌سازی. 50

4-2-1. بهینه‌سازی شرایط جداسازی. 50

4-2-2. بهینه‌سازی شرایط استخراج. 51

4-2-2-1. نوع حلال آلی. 51

4-2-2-2. اثر pH فاز گیرنده و فاز دهنده 53

4-2-2-3. اثر سرعت هم‌زدن محلول آنالیت.. 55

4-2-2-4. اثر قدرت یونی فاز دهنده 57

4-2-2-5. اثر زمان استخراج. 58

4-2-2-6. اثر دمای استخراج. 59

4-3. تعیین پارامترهای تجزیه‌ای روش استخراج. 60

4-3-1. تهیه منحنی درجه‌بندی. 61

4-3-2. فاكتور پیش تغلیظ (PF) و درصد بازیابی (R%) 61

4-3-3. تعیین حد تشخیص (LOD) 63

4-3-4. تكرارپذیری روش (RSD) 63

4-4- آنالیز نمونه حقیقی. 64

فصل پنجم: بحث و نتیجه‌گیری

5-1. مقایسه روش استخراجی با روش‌های گزارش شده‌ی دیگر مراجع. 66

5-2. نتیجه‌گیری. 69

منابع................................................................................................................................................... 70    

خلاصه انگلیسی................................................................................................................................. 83

ضمائم..................................................................................................................................................84     

 فهرست جداول                                        

جدول 1-2: کاربردهای کروماتوگرافی تقسیمی ......................................................................................................... 23

جدول 2-2: کاربردهای اخیر HF-LPME در استخراج ....................................................................................... 33

جدول 4-1: خلاصه نتایج بهینه سازی فرآیند استخراج ........................................................................................... 59

جدول 4-2: ارقام شایستگی HF-LPME داروی رالوکسیفن ............................................................................... 63

جدول 4-3: نتایج اندازه گیری رالوکسیفن در پلاسما ............................................................................................... 65

جدول 5-1: کارهای انجام شده بر روی رالوکسیفن ................................................................................................... 67

 فهرست نمودارها                                                   

نمودار 4-1: بررسی نوع حلال آلی پرکننده منافذ فیبر توخالی .............................................................................. 53

نمودار 4-2: بررسی تغییرات pH فاز دهنده درفرآیند استخراج ............................................................................. 54

نمودار 4-3: بررسی تغییرات pH فاز گیرنده درفرآیند استخراج ............................................................................ 55

نمودار 4-4: اثر سرعت همزدن بر فرآیند استخراج .................................................................................................... 56

نمودار 4-5: تاثیر قدرت یونی فاز دهنده بر فرآیند استخراج ................................................................................... 57

نمودار 4-6: تاثیر زمان برفرآیند استخراج .................................................................................................................... 58

نمودار 4-7: تاثیر دما برفرآیند استخراج ....................................................................................................................... 59

نمودار 4-8: منحنی درجه بندی نمونه در محیط آبی .............................................................................................. 60

نمودار 4-9: منحنی درجه بندی نمونه در تزریق مستقیم ........................................................................................ 62

   فهرست اشکال                                                   

شکل 1-1: روش های مختلف استخراج و میکرو استخراج ......................................................................................... 4

شکل 2-1: نمای جانبی از سیستم میکرواستخراج با حلال با استفاده از میله تفلنی ........................................... 9

شکل 2-2: نمایی از سیستم میکرو استخراج با تک قطره ........................................................................................ 11

شکل 2-3: اصول استخراج HF-LPME ................................................................................................................... 13

شکل 2-4: سیستم HF-LPME براساس پیکربندی U شکل و میله ای ......................................................... 16

شکل 2-5: طرح شماتیک از سیستم HF-LPME ................................................................................................. 17

شکل 2-6: شمایی از سیستم HF-LPME و سیستم نیمه خودکار ................................................................... 17

شکل 2-7: طرح شماتیک میکرواستخراج فاز مایع .................................................................................................... 20

شکل 2-8: شمایی از دستگاه HPLC ......................................................................................................................... 25

شکل 2-9: یک حلقه نمونه برداری کروماتوگرافی مایع ............................................................................................ 27

شکل 2-10: نسلول آشکارساز فرابنفش برای HPLC ............................................................................................ 31

شکل 2-11: ساختار شیمیایی مولکول رالوکسیفن ............................................................................................... 35

شکل 3-1: تصویر سیستم استخراج استفاده شده در آزمایشگاه ............................................................................. 42

شکل 4-1: کروماتوگرام تزریق محلول آبی رالوکسیفن در شرایط بهینه استخراج ......................................... 51

شکل 4-2: کروماتوگرام های نمونه پلاسما .................................................................................................................. 64