بررسی عفونت ریوی مایكوپلاسمایی ناشی از مایكوپلاسما مایكوئیدس واریته مایكوئیدس و مایكوپلاسما كاپری كولوم واریته كاپری كولوم در گوساله‌ها و بزهای كشتار

كلاستر مایكوپلاسما مایكوئیدس در برگیرنده مهمترین پاتوژنهای تنفسی نشخواركنندگان است كه سالیانه، خسارات اقتصادی سنگینی بر صنعت دامپروری كشورهای جهان وارد می‌كند. اخیرا شیوعهای بازپدیدی از عفونتهای پلوروپنومونی نشخواركنندگان در منطقه خاورمیانه گزارش شده است. در این شرایط تعیین وضعیت گله‌های كشور از نظر آلودگی به گونه‌های پاتوژن این كلاستر، از اهمیت خاصی برخوردار است. هنوز گزارشی از شناسایی و جداسازی گونه‌های درگیر از عفونت پلوروپنومونی در ایران بدست نیامده است. عدم برخورداری از خصوصیت پاتوگونومیك در نمونه‌های بالینی و دشواریهای فراوان جداسازی میكروارگانیسم، به ضرورت شناسایی و بكارگیری روشهای تشخیصی جایگزین افزوده است.

علاوه بر این، دستیابی به روشی كاربردی و سریع، در تشخیص عفونتهای تنفسی گله‌ها و تخمینی از وضعیت عفونت در ایران، مدنظر این تحقیق بوده است.

در این مطالعه‌، 100 نمونه ریه با ضایعات مشكوك به عفونتهای تنفسی مایكوپلاسمایی از 100 گله مشكوك (50 گله گاو،30 گله گوسفند،20 گله بز) در اطراف كرمانشاه ، در سالهای 1386-1384 جمع آوری شدند. ضایعات ماکروسکوپی شامل کبدی شدن ریه‌ها با زخم‌های خاکستری و سفید(جامد شدن) و ظاهر منقوط با یا بدون فیبرین بودند. نمونه‌ها در محیط کشت PPLO براث و آگار کشت داده شدند.پس از پاساژهای متعدد،از 23 گله مشکوک،تک کلونی تخم‌مرغی شکل مایکوپلاسما جداشد(11 گله گاو،8 گله گوسفند،4 گله بز).

امادر واكنش, PCR63 گله عفونت مایكوپلاسمای تنفسی نشان دادند (37 گله گاو، 17 گله گوسفند، 9 گله بز).

این امر، مبین این نكته است كه علیرغم اینكه جداشدن عامل مایكوپلاسمایی از نمونه‌ها در محیط كشت، اساس تعیین وضعیت عفونت‌های مایكوپلاسمایی قلمداد می‌شود، اما سخت‌رشد بودن گونه‌های مورد مطالعه در محیط كشت و عدم دستیابی سریع به نتیجه، كارآیی این روش تشخیصی را در پایش متداول عفونت گله‌ها زیر سوال برده است.

علاوه بر این، بكاربردن آنتی بیوتیكهای متنوع در دوره درمان و از بین رفتن میكروارگانیسم در خلال جمع آوری نمونه، ‌نتایج رشد در محیط كشت مایكوپلاسما را دستخوش تغییر داده است.

از این رو،‌ استفاده از روشهای مولكولی PCR بعنوان یك روش كاربردی، حساس و سریع توصیه می‌شود. پس از استخراج ‌DNA نمونه‌ها به روش فنل کلروفورم و جدا كردن نمونه‌های آلوده به مایكوپلاسما از طریق PCR ، با استفاده از پرایمر اختصاصی كلاستر مایكوئیدس نمونه‌های مایكوپلاسمایی تحت واكنش PCR قرار گرفتند.

باند bp 548، تنها در نمونه كنترل ( سویه F38) دیده شد. به منظور كنترل روند واكنش، نمونه‌ها با پرایمر اختصاصی مایكوئیدس كلونی بزرگ و پرایمر اختصاصی آگالاكتیه، به طور جداگانه PCR شدند كه نتیجه این آزمایش، یافته‌های آزمایش قبلی را تائید می‌كرد.

اگر چه این تحقیق نشان داد كه عامل عفونتهای تنفسی مشكوك در نمونه‌های مورد مطالعه نمی‌تواند از گونه‌های كلاستر مایكوئیدس باشد، منتهی تخمین میزان عفونت در گله‌های مورد مطالعه، احتیاج به تحقیقات وسیعتر با جمع‌آوری تعداد نمونه‌های بیشتر در مطالعات بعدی دارد

فهرست مطالب

الف- مقدمه1

ب-چکیده3

فصل اول:کلیات 5

1- تاریخچه 6

2- خصوصیات کلی مایکوپلاسما6

3- مقاومت مایکوپلاسماها 8

4- طبقه بندی مایکوپلاسماها 9

5- طبقه بندی کلاستر مایکوئیدس12

6- فیلوژنی14

7- ساختمان 15

1-7-ساختمان مایکوپلاسما مایکوئیدس15

2-7- ساختمان مایکوپلاسما کاپری کولوم 17

8- بیولوژی مولکولی19

9- توالی‌های تکراری23

10- پروتئینهای سطحی25

11- فاکتور حدت30

12- آنالیز پروتئین 32

13- طبقه بندی سویه‌ها 34

14- مشخصات گونه مایکوئیدس35

15- کشت و رشد گونه مایکوئیدس 38

16- کشت و رشد گونه کاپری کولوم 41

1-16- محیط Thiacourt 41

17- بیماری پلوروپنومونی واگیر گاوان44

1-17- علائم بالینی 45

2-17- علائم کالبدگشایی بیماری 47

3-17- پاتوژنز 50

1-3-17- مکانیسمهای مقابله با دستگاه ایمنی53

4-17- اختصاصیت میزبان57

5-17- انتقال بیماری 58

6-17- سیر همه گیری 59

1-6-17- مخزن59

2-6-17- راه انتقال59

7-17- پیشگیری و کنترل60

1-7-17- اقدامات لازم برای حفاظت مناطق عاری از بیماری61

2-7-17- اقدامات لازم هنگام شیوع بیماری62

3-7-17- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومی63

18- بیماری پلوروپنومونی واگیر بزان 63

1-18- علائم بالینی 64

2-18- علائم کالبد گشایی66

19- گونه مایکوپلاسما کاپریکولوم کاپریکولوم69

1-19- سندروم MASKePs...................................70

2-19- علائم بالینی71

3-19- علائم کالبد گشایی71

4-19- سندروم آگالاکتیه واگیر73

20- گونه مایکوپلاسما کاپری 73

1-20- بیماریزایی 73

2-20- علائم کالبد گشایی74

21- سیر همه‌گیری75

1-21-مخزن 75

2-21-راه انتقال76

3-21-جمعیت میزبان77

22-پیشگیری وکنترل77

1-22- اقدامات لازم برای محافظت مناطق عاری از بیماری77

2-22- اقدامات لازم هنگام شیوع بیماری78

3-22- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومی78

23-واکسن79

1-23-واکسن MmmLC 79

2-23-واکسن Mccp 79

3-23-واکسن Mcc 79 79-اختصاصیت میزبان در کلاستر مایکوئیدس 80

25-تشخیص افتراقی80

1-25-شناسایی عامل بیماری زا81

1-1-25-بررسی میکروسکوپیک اگزودای ریه از طریق تهیه اسمیر یا برش بافتی 81

2-25- تشخیص آزمایشگاهی 81

1-2-25- روش کشت و جداسازی81

1-1-2-25- انتخاب نمونه ها 82

2-1-2-25- آماده سازی نمونه ها 82

3-25- تستهای بیوشیمی83

4-25- روشهای سرولوژی85

1-4-25- عوامل موثر در آزمایشات سرولوژی 85

2-4-25- تست مهاری رشد 87

3-4-25- تست ایمونو فلورسانس 88

4-4-25- تست رسوب ژلی 88

5-4-25- تست فیکساسیون کامپلمان 89

6-4-25- تست ممانعت از هماگلوتیناسیون89

7-4-25- تست آگلوتیناسیون لاتکس90

8-4-25- تست الیزای رقابتی91

9-4-25- سایر تستهای تشخیصی 94

5-25 - مشکلات روشهای سنتی94

6-25- تشخیص با استفاده از PCR95

فصل دوم: روش کار

26- روش کار 101

1-26- جمع آوری نمونه101

1-1-26- مواد لازم101

2-1-26- بخش جمع آوری نمونه101

3-1-26- نمونه برداری103

2-26- کشت و جداسازی نمونه ها104

1-2-26- مواد لازم 104

2-2-26- طرز تهیه محیط کشت اختصاصی برای جداسازی مایکوپلاسمای نشخوار کنندگان 106

1-2-2-26- مواد لازم 106

2-2-2-26- روش تهیه محیط کشت107

3-26- استخراج DNA مایکوپلاسما109

1-3-26- روش استخراج DNA از نمونه های ارسالی109

4-26- فرایند PCR 110

1-4-26- مواد لازم 110

2-4-26- آماده سازی مواد جهت واکنش PCR112

1-2-4-26- افزوده سازی DNA نمونه‌ها 112

2-2-4-26- افزوده سازی DNA کلونیهای جدا شده115

3-2-4-26- تهیه مخلوط اصلی اولیه115

3-4-26- پرایمرها115

4-26- واکنشPCR.................

5-26- تهیه ژل الکتروفورز 118

1-5-26- طرز تهیه محلول اتیدیوم برماید119

6-26- الکتروفورز121

7-26- رویت باندهای ایجاد شده 122

فصل سوم: نتایج

27- نتایج 124

1-27- جداسازی124

1-1-27- بررسی عملکرد محیط کشت124

2-1-27- نتایج کشت نمونه های ارسالی 124

1-2-1-27- نتایج روز پنجم 125

2-2-1-27- نتایج روزهفتم تا دهم125

3-2-1-27- نتایج روزپانزدهم126

2-27- نتایج PCR 126

1-2-27- نتایج PCR نمونه ها با پرایمر جنس 126

2-2-27- تائید کلونی های جدا شده127

3-2-27- نتایج PCR نمونه ها با پرایمر کلاستر مایکوئیدس127

4-2-27- نتایج PCR نمونه ها با پرایمر گونه آگالاکتیه128

5-2-27- نتایج PCR نمونه ها با پرایمر گونه مایکوئیدس کلونی بزرگ129

3-27- نتایج کالبد گشایی130

1-3-27- معیار انتخاب 130

فصل چهارم: بررسی نتایج

نمودارها 131

فصل پنجم: بحث

28- بحث 139

1-28- ضایعات کالبد گشایی139

2-28- میزان وقوع عفونت تنفسی مایکوپلاسما 141

3-28- روش کشت142

4-28- روش PCR 147

5-28- فراوانی گونه ها 152

29- خلاصه انگلیسی159

30- منابع 160

فهرست تصاویر:

 تصویر شماره 1: کلونی تخم مرغی شکل مایکوپلاسما پس از سومین ساب کالچر 125

تصویر شماره 2: آزمایش PCR برای تشخیص جنس مایکوپلاسما در نمونه ریه127

تصویر شماره 3: آزمایش PCR برای تشخیص کلاستر مایکوئیدس در نمونه ریه128

تصویر شماره 4: آزمایش PCR برای تشخیص گونه آگالاکتیه درنمونه ریه..... 129

تصویر شماره 5: آزمایش PCR برای تشخیص گونه مایکوئیدس مایکوئیدس کلونی بزرگ 130

فهرست جداول

 جدول1: طبقه بندی مایکوپلاسما 11

جدول 2: معرفی اعضا کلاستر مایکوئیدس و خصوصیات بیماریزایی آنها 11

جدول 3: احتیاجات غذایی برای رشد مایکوپلاسماهای کلاستر مایکوئیدس............. 39

جدول 4 : مقادیر موردنیاز جهت تهیه مخلوط اصلی اولیه112

جدول 5: مواد مورد نیاز واکنش تکثیر 114

جدول6 : پرایمرهای استفاده شده در واکنش تکثیر 116

جدول 7 : برنامه واکنش پرایمرها 118

جدول8: : فرمول تهیه محیط TBE(5X).......................... 120

جدول9: میزان اتیدیوم بروماید مصرفی جهت ساختن مقادیر متفاوت ژل120

فهرست نمودارها

نمودار شماره 1: درصد مایکوپلاسمای جدا شده به روش کشت در عفونت تنفسی

گله‌های مورد مطالعه132

نمودارشماره 2: درصد حضور مایکوپلاسما درعفونت تنفسی گله‌های مورد

مطالعه به روشPCR 132

نمودار شماره3 : مقایسه روشهای کشت و PCR در تشخیص مایکوپلاسما ی موجود در عفونت تنفسی گله‌های مورد مطالعه.......................... 133

نمودار شماره4: مقایسه نتایج کشت وPCR نمونه‌ها در گله‌های مورد مطالعه (n=100) 133

نمودار شماره 5: مقایسه نتایج کشت و PCR مایکوپلاسما در گاو (n=50) ...... 134

نمودار شماره 6: مقایسه نتایج کشت و PCR مایکوپلاسما در گله های گوسفند (n=30) 134

نمودار شماره 7: مقایسه نتایج کشت و PCR در گله‌های بز (n=20).................. 135

نمودار شماره8: نمودار شماره 8:مقایسه نتایج تشکیل کدورت در محیط براث و PCR مایکوپلاسما در گله‌های مورد مطالعه (n=100)... 135

نمودار شماره 9: نمودار شماره9:مقایسه نتایج ایجاد کدورت در محیط براث و جداسازی مایکوپلاسما در گله‌های مورد مطالعه (n=100) . 136

نمودار شماره 10: نمودار شماره10: مقایسه نتایج تشکیل کدورت در محیط براث و PCR مایکوپلاسما در گله‌های گاو(n=50)..................136

نمودار شماره 11: نمودار شماره 11:مقایسه نتایج تشکیل کدورت در محیط براث و PCR مایکوپلاسما در گله‌های بز (n=20)................... 137

نمودار شماره12: مقایسه نتایج تشکیل کدورت در محیط براث و PCR مایکوپلاسما در گله‌های گوسفند (n=30) ..................... 137