کلونینگ و بیان بخش های آنتی ژنیک سیتوتوکسین مرتبط با ژن A  (CagA) هلیکو باکتر پیلوری در باکتری اشرشیا کلی و امکان سنجی تولید IgY در زرده تخم مرغ

هلیکوباکتر پیلوری شایع ترین پاتوژن گوارشی است که نیمی از مردم دنیا را آلوده ساخته و مهمترین علت بیماری‌های معده ای-روده ای از جمله گاستریک مزمن، زخم معده و دوازدهه، سرطان معده و لنفوما است.  ژن CagA (سیتوتوکسین مرتبط با ژن A) یکی مهمترین شاخص‌های بیماری زای این باکتری است.  در این مطالعه به منظور همانه سازی بخش‌های آنتی ژنیک ژن CagA و بررسی تولید IgY در زرده تخم مرغ در ابتدا بر اساس برنامه‌های بیوانفورماتیکی قطعه حاوی اپی‌توپ‌های اصلی ژن CagA به طول 996 جفت باز شناسائی شد سپس این قطعه به کمک PCR از ژنوم هلیکوباکتر پیلوری موجود در بیوپسی معده 30 بیمار مبتلا به این باکتری جدا شده و با استفاده از هضم آنزیمی به ناقل  pET32a و سپس به داخل میزبان‌های کلون سازی و بیانی وارد شد.  نتایج توالی یابی کلونیگ موفق ژن CagA را نشان داد و در نهایت ترکیب پروتئینی بدست آمده توسط روش SDS-PAGE و دات بلات تائید شد. در مرحله بعد ترکیب پروتئینی بدست آمده به 3 مرغ از نژاد HY-LINE تزریق شد. تخم مرغ‌ها به مدت 10 هفته جمع آوری شدند و IgY تولید شده در زرده تخم مرغ آنها با استفاده از روش SDS-PAGE بررسی و تائید شد.

 کلمات کلیدی: مهندسی آنتی بادی،کیت تشخیصی، ایمنوژنتیک

فهرست مطالب

1 مقدمه.. 1

1-1 اهمیت موضوع.. 1

1-2 اهداف تحقیق.. 4

2 بررسی منابع.. 5

2-1 مکمل‌ها و غذاهای عمل گرا.. 5

2-1-1 تفاوت غذای عمل گرا و مکمل غذائی.. 6

2-2 ایمنوگلوبین Y. 6

2-2-1 ایمنوگلوبین زرده ی تخم مرغ (IgY).. 7

2-2-2 ویژگی‌ها.. 9

2-2-3 کاربرد‌های بیوآنالایتیک.. 9

2-2-4 استفاده در مواد غذائی.. 10

2-3 هلیکو باکتر پیلوری.. 11

2-3-1 علائم و نشانه‌ها.. 11

2-3-2 میکروبیولوژی.. 12

2-3-3 ژنوم.. 13

2-3-4 زیرواحد CagA هلیکوباکتر پیلوری.. 14

2-3-5 نقش CagA در سرطان.. 15

2-3-6 پاتوفیزیولوژی.. 15

2-3-7 التهاب، ورم معده و زخم.. 16

2-3-8 جزیره بیماریزائی Cag.. 17

2-3-9 سرطان.. 18

2-3-10 آسیب شناسی.. 19

2-3-11 پیشگیری.. 19

2-3-12 درمان.. 20

2-3-13 پیش بینی بیماری.. 21

2-3-14 بقاء هلیکوباکتر پیلوری.. 22

2-3-15 همه گیر شناسی باکتری (Epidemiology).. 24

2-4 آنتی ژن‌ها.. 25

2-4-1 ساختمان آنتی ژن.. 25

2-5 اپی توپ‌ها.. 26

2-5-1 انواع اپی توپ‌ها.. 26

2-5-2 عملکرد.. 27

2-5-2-1 اپی توپ‌های سلول T.. 27

2-5-3 واکنش متقاطع.. 28

2-5-4 نقشه برداری اپی توپ فضائی.. 28

2-5-5 نشانه‌های اپی توپ.. 28

2-6 تحقیقات انجام شده در این زمینه.. 29

2-7 ابزار‌های مورد استفاده.. 38

2-7-1 دات بلاتینگ.. 38

2-7- 2 نرم افزار CLC Work Bench5. 38

2-7-3 نرم افزار Mega5. 39

2-7-4 ابزار BLAST.. 39

3 مواد و روش‌ها.. 40

3-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 40

3-2 تهیه باکتری هلیکو باکتر پیلوری.. 41

3-3 استخراج DNA و تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده   41

3-3-1 تعیین کمیت و کیفیت DNA با ژل آگارز.. 41

3-4 تعیین غلظت DNA استخراج شده.. 42

3-5 طراحی آغازگرها.. 42

3-6 انجام واکنش PCR.. 43

3-7 خالص سازی محصول PCR.. 44

3-7-1 بررسی بر روی ژل الکتروفورز.. 45

3-8 طرز تهیه محلولهای مورد استفاده در کلونینگ.. 45

3-8-2 محلول غلیظ آنتی بیوتیک آمپیسیلین.. 46

3-8-3 محلول غلیظ IPTG  (0. 1M).. 46

3-8-4 محلول غلیظ X-Gal  (20mg/ml).. 46

3-8-5 محیط کشت LB مایع.. 46

3-8-6 محیط کشت LB-Agar جامد.. 47

3-9-2 هضم pET-32a  (+). 49

3-9-3 خالص سازی pET-32a  (+) و قطعه هدف.. 49

3-9-4 نانودراپ محصولات خالص شده.. 50

3-9-5 انجام واکنش الحاق قطعه هدف ژن CagA با pET-32a  (+). 50

3-9-6 جوان سازی باکتری DH5α.. 51

3-9-7 تهیه سلول‌های مستعد DH5α.. 52

3-9-8 انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری.. 52

3-9-9 کشت پرگنه‌‌ها و غربال گری باکتری های نوترکیب   53

3-9-10 کلونی PCR.. 53

3-9-11 استخراج پلاسمید نوترکیب.. 54

3-9 -12 تایید کلونیها از طریق هضم آنزیمی.. 55

3-10 توالی یابی.. 56

3-11 انتقال پلاسمید pET-32a (+) حاوی ژن هدف به باکتری BL21 (DE3). 56

3-12 تحریک بیان ژن هدف.. 56

3-13 استخراج پروتئین از باکتری.. 57

3-14 الکتروفورز پروتئینها به روش SDS-PAGE. 58

3-14-1 مراحل بستن ژل به صورت زیر انجام شد:.. 59

3-15 دات بلات.. 61

3-16 محلولها و بافرها.. 62

3-16-1 بافر شستشو یا محلول TBS. 62

3-16-2 محلول بلوکه کننده.. 62

3-16-3 بافر شستشو یا محلول TBS-T.. 62

3-16-4 آنتیبادی اولیه.. 62

3-16-5 آنتیبادی ثانویه.. 62

3-16-6 روش تهیه محلول رنگ آمیزی DAB.. 62

3-17 خالص سازی پروتئین.. 64

3-18 آماده سازی آنتی ژن ایمنی زا برای تزریق به مرغ   64

3-19 ایمنی زائی مرغ‌ها جهت تولید آنتی بادی اختصاصی   65

3-19-1 تزریق اولیه:.. 65

3-19-2 تزریق‌های ثانویه  (Booster injection).. 66

3-20 جمع آوری و ذخیره تخم مرغ.. 66

3-21 جداسازی IgY با استفاده از روش پلی اتیلن گلایکول 6000   66

3-22 بررسی IgY به روش الکتروفورز SDS-PAGE و دات بلات   67

4 نتایج و بحث.. 67

4-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 67

4-2 تایید آلودگی نمونه‌های بیوپسی.. 69

4-3 تعیین کمیت و کیفیت DNA.. 69

4-4 بررسی محصولات PCR.. 70

4-5 خالص سازی محصول PCR.. 71

4-6 هضم PET32a (+) و ژن CagA.. 71

4-7 کلونینگ ژن CagA در باکتری DH5α.. 72

4-8 تأیید صحت قطعه کلونشده در pET32a (+). 73

4-9 نتایج کلونی PCR.. 73

4-10 تایید نتایج کلونی PCR با استفاده از T7. 74

4-11 استخراج پلاسمید و انجام هضم آنزیمی.. 75

4-12 توالی یابی.. 76

4-13 آنالیز فیلوژنتیکی توالی آمینواسیدی CagA.. 76

4-14 بیان ژن.. 78

4-15 SDS-PAGE. 78

4-16 دات بلات.. 79

4-18 تولید IgY ضد هلیکو باکتر پیلوری-CagA در زرده تخم مرغ   81

5 نتیجه گیری و پیشنهادات.. 85

فهرست شکل‌ها

شکل 4-1.  نتایج نرم افزار bcepred. 68

شکل 4-2. تست اوره آز انجام شده بر روی نمونه‌های بیوپسی. 69

شکل 4-3. تعیین کیفیت و کمیت DNA. 70

شکل4-5. خالص سازی محصول PCR . 71

شکل4-6. هضم ناقل بیان و قطعه هدف... 72

شکل4-7. کشت خطی از تک کلون‌های رشد کرده بر روی محیط کشت LB-آگار حاوی آمپی سیلین.. 73

شکل 4-8. کلونی PCR. 74

شکل4-9. کلونی PCR با استفاده از پرایمر T7 و T-terminatoor. 75

شکل 4-10. استخراج پلاسمید نوترکیب و هضم آنزیمی.. 76

شکل 4-12. بررسی بیان پروتئین نوترکیب با الکتروفورزSDS-PAGE 78

شکل 4-13. دات بلات پروتئینهای استخراج شده. 79

شکل 4-14.تعیین غلظت پروتئین با استفاده از روش برادفورد. 81

شکل 4-15.خالص سازی پروتئین و حذف باند‌های غیر اختصاصی. 81

شکل 4-16. الکتروفورز SDS-PAGE به منظور بررسی پروتئین زنجیره سبک و سنگین IgY استخراج شده از زرده تخم مرغ   82

 فهرست جدول‌ها

جدول 3-1 مواد و مقادیر لازم برای انجام PCR یک واکنش.... 43

جدول3-2. برنامه حرارتی مورد استفاده جهت تکثیر نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 44

جدول3-3 مواد مورد نیاز جهت تهیه محیط کشت LB مایع.. 46

جدول3-4 مواد مورد نیاز جهت تهیه محیط کشت جامد LB-Agar. 47

جدول 3-5 مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم قطعه هدف ژنCagA.. 48

جدول 3-6. مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم pET-32a (+) 49

جدول3-7. مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش الحاق.. 50

جدول 3-8. مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم پلاسمید pET32a (+)-CagA.. 55

جدول3-9. مواد مورد نیاز برای تهیه بافر Laemmli buffer samples 5X. 58

جدول3-10 مواد و مقادیر لازم جهت تهیه ژل پایینی SDS-PAGE. 58

جدول 3-11 مواد لازم جهت بستن ژل بالایی SDS-PAGE. 59

جدول3-12. مواد و مقادیر مورد نیاز برای بافر 5X تانک SDS-PAGE. 59