ارزیابی میزان تولید داروی دسفرال از سویه استرپتومایسس پیلوسوس به روش بیولوژیك

چكیده   

دسفری اكسامینB،‌ تنها سیدروفوری است كه فرم مزتیله آن (نمك متان سولفونات دسفری اكسامین B) با نام تجاری دسفرال جهت درمان بیماران تالاسمی، به منظور شلاته كردن بار اضافی آهن، استفاده می گردد.

به همین منظور جهت تولید دسفری اكسامین B، از سویه استرپتومایسس پیلوسوس استفاده گردید و سویه مربوطه در محیط كشت Soy bean كشت داده شد و دسفری اكسامین آن بوسیله استفاده از محلول فنل- كلروفرم و اتر استخراج گردید. به منظور طراحی این سیستم بیولوژیكی و افزایش بهره برداری از محصول مذكور از منابع كربن و نیتروژن مختلف استفاده گردید و تاثیر هر یك بر میزان دسفری اكسامین تولیدی بررسی شد. چنانچه مشاهده گردید كه اسید آمینه ترئونین، افزایش قابل ملاحظه ای بر دسفری اكسامین تولیدی از سویه مذكور دارد و مقدار %125/0 ترئونین، در محیط كشت Soy bean، بسیار مطلوب می باشد. از طرفی اثر ویتامین تیامین (B₁)بررسی گردید و مشاهده شد كه تاثیر مثبت بر دسفر اكسامین تولیدی دارد و در رده بعد از اسید آمینه ترئونین قرار می گیرد. همچنین اثر اسید آمینه لوسین نیز بر تولید دسفری اكسامین مثبت بوده و در رده بعد از ویتامین تیامین (B₁) قرار می گیرد.

در ایـن تحقـیق از شلاته كننـده های كاتیونی EDTA، 8-hydroxyquinoline  در محـیط كشت Soy bean استفاده شد و مشاهده گردید كه شلاته كننده های مذكور اثر منفی بر تولید دسفری اكسامین  دارند در نتیجه، كاتیونها، اثر مثبت بر افزایش میزان دسفری اكسامین تولیدی خواهند داشت به همین منظور مواد معدنی مختلف از جمله اثر CaCl₂.2H₂O,MgSO₄.7H₂O,ZnSO₄.7H₂O, MnCl₂, FeSO₄.7H₂O

و همچنین  اثرCaCl₂.2H₂O,MgSO₄.7H₂O به طور همزمان در محیط كشت Soy bean بررسی گردید.

در این تحقیق نتایج مطلوبی بدست آمد، بطوری كه كلسیم (بصورت CaCl₂.2H₂O) اثر قابل ملاحظه‌ای بر افزایش میزان دسفری اكسامین تولیدی از سویه مذكور دارد و مقدار 8/2، و 2، CaCl₂.2H₂O سبب افزایش قابل توجهی بر میزان محصول مذكور می گردد. و بدین ترتیب تاثیر مثبت كلسیم، بر تولید دسفری اكسامین مشخص گردید.

در این آزمایشات تاثیر مثبت روی، منیزیم و منگنز بر دسفری اكسامین تولیدی آشكار گردید بطوری كه غلظت  ^2-10 × 4/0، ZnSO₄.7H₂O و  6/0، MgSO₄.7H₂O و  2، MnCl₂ سبب افزایش تولید دسفری اكسامین شد.

از طرفی استفاده همزمان CaCl₂.2H₂O,MgSO₄.7H₂O در محیط كشت Soy bean اثر منفی بر تولید دسفری اكسامین را نشان داد.

همچنین بررسی ها در مورد آهن (بصورت FeSO₄.7H₂O)‌ نشان داد كه افزایش غلظت آهن، سبب كاهش میزان دسفری اكسامین تولیدی گردید.

و اینگونه با استفاده از منابع نیتروژن و مواد معدنی مختلف بهینه سازی محیط كشت انجام گرفت و تولید دسفری اكسامین از سویه استرپتومایسس پیلوسوس به میزان قابل ملاحظه ای افزایش یافت.

در این تحقیق، پروتئاز تولیدی از سویه استرپتومایسس پیلوسوس نیز بوسیله روش لوری (Lowry) اندازه گیری شد و اثر روی بصورت ZnSO₄.7H₂Oو آهن بصورت FeSO₄.7H₂O نیز بررسی گردید و مشاهده شد که افزایش غلظت روی، سبب افزایش پروتئاز تولیدی، از سویه مذکور گردید.

فهرست مطالب:

چكیده................................................ 1

مقدمه................................................ 3

فصل اول

1-1 - تالاسمی......................................... 8

1-2-اتیولوژی و سبب شناسی تالاسمی...................... 8

1-2-1 - خون شناسی.................................... 9

1-2-2- خون سازی و گلبولهای قرمز..................... 10

1-3- تالاسمی و انواع آن.............................. 10

1-3-1 آلفا تالاسمی................................... 10

1-3-2- بتا تالاسمی................................... 11

1-3-2-1 بتا تالاسمی مینور(سالم ناقل)................. 11

1-3-2-2 – بتا تالاسمی ماژور( بیماری تالاسمی).......... 12

1-3-2-3-بتا تالاسمی بینابینی......................... 13

1-4- تشخیص تالاسمی................................... 13

1-5- درمان تالاسمی................................... 13

1-6- فیزیولوژی عنصر آهن و اهمیت آن در بدن انسان..... 14

1-6-1- مسمومیت حاد آهنی............................. 15

1-7- دسفرال......................................... 16

1-7-1- نحوه استفاده از داروی دسفرال................. 17

1-7-2-كاربردهای داروی دسفرال در پزشكی............... 18

1-7-3- عوارض ناشی از داروی دسفرال................... 19

1-7-4- اقدامات احتیاطی در مورد داروی دسفرال......... 19

1-7-5- ملاك توقف درمان بوسیله دسفرال................. 20

فصل دوم

2-1-  سیدرو فورها................................... 22

2-1-1- هیدروكسامات ها............................... 24

2-1-2-فنولات ها یا كاتكولات ها........................ 25

2-2- دسفری اكسامین ها............................... 26

2- 2-1 – ساختمان دسفری اكسامین...................... 28

2-2-2- دسفراكسامین بصورت آنتی اكسیدان............... 28

2-2-3 – خصوصیات فیزیكو و شیمیایی دسفراكسامین........ 29

2-2-4- مكانیسم دسفراكسامین در جلوگیری از بیماریهای با بار اضافی آهن.................................................... 29

2-2-5- تشكیل رادیكال  DFO nitroxide.................... 30

2-3-  دسفری اكسامین B............................... 31

2-3-1- بیوسنتر دسفری اكسامین B...................... 33

2-3-2- ژنهای كد كننده دسفری اكسامین B............... 33

2-4- تولید كننده­های دسفری اكسامین................... 34

2-5- اهمیت آهن بر روی میكروارگانیسمها............... 35

2-6- مكانیسم عمل سیدروفورها در ارتباط با انتقال آهن به درون سلول میكروارگانیسمها..................................... 36

2-7- تولید، استخراج و تخلیص دسفری اكسامین B......... 37

فصل سوم

3-1- اكتینومیست ها.................................. 40

3-2- استرپتومایسس ها................................ 43

3-2-1- پاتولوژی..................................... 43

3-2-2 – مرفولوژی و ساختمان.......................... 43

3-2-3- مشخصات كلنی................................. 454

3-2-4- اسپورزایی.................................... 47

3-2-5- تركیبات پوشش سلولی........................... 49

3-2-6- تغذیه و فاكتورهای موثر بر رشد و خصوصیات فیزیكوشیمیایی 49

3-2-6-1- تغذیه...................................... 49

3-2-6-2- اكسیژن..................................... 50

3-2-6-3 - رطوبت..................................... 50

3-2-6-4- دما........................................ 51

3-2-6-5- pH......................................... 51

3-2-6-6- اكولوژی.................................... 52

3-2-6-7- بیولوژی توسعه یافته استرپتومایسس........... 53

3-2-7- انواع فرآورده های میكروبی.................... 56

3-2-7-1- متابولیت های اولیه......................... 56

3-2-7-2- متابولیت های ثانویه........................ 56

3-2-7-2-1- آنتی بیوتیك ها........................... 58

3-2-7-2-1-1- فیزیولوژی و تنظیم تولید آنتی بیوتیك.... 58

3-2-7-3- آنزیمها.................................... 63

3-2-7-3-1- پروتئازها................................ 63

3-2-7-3-1-1- پروتئازهای اسیدی....................... 67

3-2-7-3-1-1-1- رنین................................. 67

3-2-7-3-1-2- پروتئازهای خنثی........................ 67

3-2-7-3-1-3- پروتئاز های قلیایی..................... 67

3-2-7-3-1-3-1- فرآیند تخمیر پروتئازهای قلیایی....... 68

3-2-7-3-1-3-2- تعیین فعالیت پروتئاز قلیایی.......... 69

3-2-7-3-1-4- بازدارنده های فعالیت آنزیم پروتئاز وشلاته کننده ها   69

3-2-7-3-1-5- تجزیه.................................. 71

3-2-7-3-1-6- پروتئاز ها و استرپتومایسسها............ 71

3-2-8- محیط كشت  تخمیر صنعتی........................ 71

3-2-8-1- نیازهای غذایی میكروارگانیسم‌ها.............. 71

3-2-8-1-1- كربن..................................... 74

3-2-8-1-1-1- منابع کربن و استرپتومایسس ها........... 77

3-2-8-1-2-نیتروژن................................... 78

3-2-8-1-2-1-  منابع نیتروژن و استرپتومایسس ها....... 80

3-2-8-1-3- هیدروژن و اكسیژن......................... 80

3-2-8-1-4- مواد معدنی............................... 80

3-2-8-2-تنظیم كننده های متابولیكی................... 81

3-2-8-3- ضد كف ها................................... 82

3-2-9- بیوسنتز  در استرپتومایسس ها.................. 83

فصل چهارم

4-1- دستگاه های مورد استفاده........................ 86

4-2- وسایل مورد استفاده............................. 86

4-3 - محیط های كشت مایع برای رشد باكتری............. 88

4-4- محیط های كشت جامد برای رشد باكتری.............. 89

4-5- محیط های جامد برای تولید اسپور................. 89

4-6- مواد لازم جهت رنگ آمیزی گرم..................... 90

4-7- مواد لازم جهت استفاده از میكروسكوپ نوری......... 91

4-8- محیط مورد استفاده جهت شناسایی كیفی دسفری اكسامین: محیط Des₄  91

4-9- محیط مورد استفاده جهت اندازه گیری تولید دسفری اكسامین محیط Soy bean ................................................ 91

4-10- مواد لازم جهت نگهداری و ذخیره باكتری ها........ 92

4-11- معرف های دسفری اكسامین........................ 92

4-12- مواد لازم جهت رسم منحنی استاندارد دسفری اكسامین B 92

4-13- مواد لازم جهت استخراج دسفری اكسامین............ 92

4-14- مواد لازم جهت تهیه محلول Lysing Buffer............ 93

4-14-1 – مواد لازم جهت تهیه محلول Tris Hcl............. 93

4-15- محلول كازئین %5/0 دربافر فسفات................ 93

4-15-1- بافر فسفات (PBS)............................. 93

4-16- محلول لوری (Lowry)............................. 93

فصل پنجم

5 – ١- تهیه و آماده سازی سویه استرپتومایسس پیلوسوس.. 98

5 ـ ٢ ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیكی سویه استرپتومایسس پیلوسوس   98

5-٢-١- خصوصیات ماكروسكوپی........................... 99

5- ٢-١-١- كشت استرپتومایسس پیلوسوس بر روی محیط جامد. 99

5-٢-١-٢- كشت استرپتومایسس پیلوسوس در محیط مایع...... 99

5-٢-٢ خصوصیات میكروسكوپی............................ 99

5-٢-٢-١- تهیه لام از محیط كشت جامد................... 99

5-٢-٢-٢- تهیه لام از محیط كشت مایع.................. 100

5ـ ٢ـ٢ـ ٣ـ رنگ آمیزی گرم........................... 100

5 ـ ٣ـ تهیه مایع تلقیح............................. 100

5 ـ ٣ـ ١ـ تهیه محیط ذخیره.......................... 101

5 ـ ٣ـ ٢ـ تهیه سوسپانسیون اسپور.................... 101

5ـ ٤ـ رسم منحنی رشد استرپتومایسس پیلوسوس........... 101

5ـ ٥ـ بررسی تغییرات  pH در محیط كشت Soybean......... 102

5ـ ٦ـ تولید دسفری اكسامین توسط استرپتومایسس پیلوسوس 102

5ـ ٦ـ ١ـ تشخیص كیفی دسفری اكسامین.................. 102

5ـ ٦ـ ٢ـ سنجش میزان تولید دسفری اكسامین در هر روز.. 103

5-6-3- رسم منحنی استاندارد دسفرال.................. 103

5-٧ـ استخراج دسفری اكسامین بوسیله فنل-كلروفرم...... 104

 5 ـ ٧ـ ١ـ مزتیله كردن دسفری اكسامین............... 105

5-8- تعیین وجود دسفری اكسامین B در ماده استخراج شده 105

5ـ ٩ـ  بهینه سازی محیط كشت تولید دسفری اكسامین..... 107

5ـ ٩ـ ١ـ بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اكسامین 107

5 ـ ٩ـ ١ـ ١ـ بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اكسامین در یك محدوده غلظت..................................... 107

5ـ ٩ـ ٢ـ بررسی اثر اسیدآمینه ترئونین و اسید آمینه لوسین و ویتامین تیامینB₁)  ( برتولید دسفری اكسامین .................. 108

5 ـ ٩ـ ٣ـ بررسی گلوكز و ملاس و سوكروز بر تولید دسفری اكسامین  108

5ـ ٩ـ ٤ـ بررسی اثر شلاته كننده های كاتیون بر تولید دسفری اکسامین................................................... 108

5 ـ ٩ـ ٥ـ  استفاده از محیط كشت عصاره مخمر به جای استفاده از محیط كشت Soybean............................................. 109

5 ـ ٩ـ ٦ـ بررسی اثر مواد معدنی مختلف بر میزان تولید دسفری اكسامین................................................... 109

5 ـ٩ـ٦ـ١ـ بررسی تاثیر مواد معدنی در غلظت های مختلف بر میزان تولید دسفری اكسامین...................................... 111

5 ـ ١٠ - بررسی پروتئاز تولیدی از استرپتومایسس پیلوسوس در حضور شلاته  كننده ها و مواد معدنی مختلف........................ 112

5 ـ ١٠ـ ١ـ كشت باكتری و سنجش پروتئاز............... 112

5 ـ ١٠ـ 2ـ تخلیص كازئین............................ 113

فصل ششم

6ـ ١ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیكی ماكروسكوپی استرپتومایسس پیلوسوس................................................... 115

6ـ ١ـ ١­ـ خصوصیات ماكروسكوپی سویه استاندارد بر روی محیط كشت جامد................................................... 115

6 ـ ١ـ٢ـ خصوصیات ماكروسكوپی سویه استاندارد در محیط كشت مایع  115

6 ـ ٢ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیكی میكروسكوپی استرپتومایسس پیلوسوس................................................... 116

6 ـ٣ـ رسم منحنی رشد استرپتوماسیس پیلوسوس در محیط كشت MYB    116

6-4- رسم منحنی pH بر حسب زمان در محیط كشت Soybean حاوی سویه استرپتومایسس پیلوسس................................ 118

6 ـ ٥ـ تشخیص كیفی و كمی دسفری اكسامین تولیدی....... 120

6-5-1- تشخیص كیفی و تولید و یا عدم تولید دسفری اكسامین 120

6ـ٥ـ2ـ رسم نمودار استاندارد دسفرال................. 120

6ـ٥ـ3ـ میزان دسفری اكسامین تولیدی در هر روز توسط سویه استرپتومایسس پیلوسوس در محیط Soy bean............... 121

6-6- نتایج مربوط به استخراج دسفری اكسامین تولید شده توسط سویه استرپتومایسس پیلوسوس............................... 122

6-6-1- نتایج مربوط به تأیید وجود دسفری اكسامین B در ماده استخراج شده................................................ 122

6-7-  بهینه سازی محیط كشت تولید دسفری اكسامین...... 124

6-7-1  بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اكسامین   124

6-7-1-1- بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اكسامین در یك محدوده غلظت........................................ 124

6ـ7ـ ٢ـ بررسی اثر اسید آمینه های ترئونین و لوسین و ویتامین تیامین (B₁ ).............................................. 126

6 ـ 7ـ٣ـ بررسی گلوكز ، ملاس، سوكروز بر تولید دسفری اكسامین    126

6ـ 7ـ ٤ـ بررسی اثر شلاته كننده های كاتیون بر میزان تولید دسفری اكسامین............................................ 127

6ـ 7ـ ٥ـ استفاده از محیط كشت عصاره مخمر به جای استفاده از محیط كشت Soybean............................................. 128

6 ـ 7ـ ٦ـ بررسی اثر مواد معدنی مختلف بر میزان تولید دسفری اكسامین................................................... 128

6 – 7 – 6 – 1 – بررسی اثر مواد مختلف با غلظت متفاوت بر میزان تولید دسفری اكسامین ............................... 130

6ـ8ـ بررسی پروتئاز تولیدی از استرپتومایسس پیلوسوس در حضور شلاته‌كننده و مواد معدنی مختلف....................... 139

فصل هفتم

- بحث و نتیجه گیری................................. 143

- پیشنهادات........................................ 147

- فهرست منابع...................................... 149